Reducción del grado alcohólico del vino mediante levaduras no-Saccharomyces

 Publicado el Por David Castrillo , Eva Rabuñal , Noemi Neira , Pilar Blanco

Artículo con tablas en PDF adjunto.

El aumento de la temperatura debido al cambio climático afecta al desarrollo fenológico de la vid. En la mayoría de las zonas se produce un adelanto de la maduración tecnológica de la uva, que no siempre va acompañada de la madurez fenológica y/o aromática deseable. Retrasar la vendimia conduce a una concentración de azúcar más alta y a una reducción de acidez en los mostos, que dan lugar a vinos de mayor grado alcohólico, menor acidez y variaciones en la composición aromática y las características organolépticas.

A nivel enológico existen diversas técnicas que permiten reducir el grado alcohólico de los vinos. Entre ellas, el uso de levaduras no-Saccharomyces constituye una alternativa biológica de gran interés, no solo por el potencial de estas levaduras para disminuir el grado, sino también por su papel sobre las propiedades organolépticas del vino (Varela et al., 2015). Dentro de las especies no-Saccharomyces, la mejor estudiada y con mayor disponibilidad a nivel comercial es Torulaspora delbrueckii, que da lugar a vinos con menor graduación, mayor contenido en glicerol y diferencias en el perfil aromático que mejoran la calidad del vino, aunque estas características dependen de la cepa utilizada (Benito, 2018). Otras especies como Metschnikowia spp. son muy apreciadas por su papel en la liberación de aromas y/o su potencial para reducir el grado en los vinos (Varela et al., 2016).

Menos extendida está la aplicación de Lachancea thermotolerans, especie a la que se le atribuye una reducción del pH así como un aumento de 2-feniletanol y glicerol en el vino (Goddi et al., 2013), aunque su implantación durante la fermentación es más problemática. Más recientemente se está trabajando con Starmerella bacillaris, que ofrece la posibilidad de reducir el alcohol y aporta mayor contenido en glicerol y ésteres a los vinos (Englezos et al., 2016). Un factor importante es la proporción de inóculos y la interacción entre cepas, ya que normalmente se utilizan de forma secuencial con Saccharomyces cerevisiae. Con las especies mencionadas y otras como Pichia kluyveri o Zygosaccharomyces bailii se han descrito reducciones de etanol de hasta 1,6% v/v en los vinos.

En la Estación de Viticultura y Enología de Galicia (EVEGA) disponemos de una colección de levaduras vínicas autóctonas aisladas de uvas de cultivo ecológico y convencional de diferentes zonas de Galicia. En este trabajo se presentan los resultados de la elaboración de vino utilizando cultivos mixtos mediante inoculación secuencial de levaduras no-Saccharomyces y Saccharomyces. Se evaluó la cinética fermentativa y la capacidad de implantación de las cepas inoculadas, así como su influencia en las características químicas y sensoriales del vino, en particular sobre el grado alcohólico.

Material y métodos
Levaduras utilizadas y preparación de inóculos:

Las levaduras utilizadas en este estudio son cepas autóctonas de la colección de la EVEGA: S. cerevisiae XG3, S. bacillaris Sb474, L. thermotolerans Lt93, Metschnikowia fructicola Mf278 y T. delbrueckii Td315. Los inóculos se prepararon en medio YPD a partir de un preinóculo hasta obtener la biomasa suficiente.

Procesado de la uva y fermentación:
Los ensayos se realizaron en la bodega experimental de la EVEGA con uva blanca (variedad Treixadura) procedente de la finca propia del centro. Las uvas se despalillaron y prensaron, añadiendo Antiox Aromas (20 g/hL) y Zymolyase Clar FCE (2 g/hL) para evitar oxidaciones y facilitar el desfangado en frío durante 24 horas. El mosto desfangado (231,8 g/L azúcares y 5,1 g/L de acidez total) se distribuyó en depósitos de acero inoxidable de 5 L. Los ensayos se realizaron por triplicado en una cámara fría a temperatura controlada de 16ºC. Inicialmente se añadieron 1x108 cél/mL de cada una de las levaduras en los depósitos correspondientes, excepto en el control de fermentación espontánea que no se inoculó ninguna. En las fermentaciones con levaduras no-Saccharomyces, se inoculó además S. cerevisiae XG3 de forma secuencial cuando la densidad bajó 10-15 puntos. Las fermentaciones se controlaron mediante medida diaria de la densidad y la temperatura. Además, en la fase inicial (Fi), tumultuosa (Ft) y final (Ff) de la fermentación se tomaron muestras para el control de implantación de las levaduras inoculadas. Una vez terminada la fermentación, los vinos se trasegaron y sulfitaron (50 mg/L), se estabilizaron por frío, y se embotellaron para posteriores análisis.

Control microbiológico de las fermentaciones:
Las muestras de mosto, Fi, Ft y Ff se diluyeron de forma adecuada y se sembraron en medio WL Nutrient Agar (Scharlau Microbiology). Las placas se incubaron a 28ºC hasta la aparición de colonias visibles, tras lo cual se procedió al recuento de levaduras y al aislamiento de un número representativo de colonias de cada muestra para su posterior identificación. También se anotó la proporción de cada tipo de colonia.

Para la diferenciación de los aislados en levaduras de tipo Saccharomyces y no-Saccharomyces se utilizó el medio selectivo Lysine Medium (Oxoid), en el que las primeras no crecen. La identificación de las levaduras a nivel de especie se realizó mediante amplificación por PCR del gen 5.8S rRNA y los dos espaciadores ribosomales internos (ITS). Los aislados de tipo Saccharomyces se caracterizaron a nivel de cepa mediante la técnica de análisis de los patrones de restricción del mtDNA (mtDNA-RFLPs).

Análisis químico y sensorial de los vinos:
En el vino se determinaron grado alcohólico, azúcares reductores, acidez total, acidez volátil, pH, glicerol y sulfuroso libre y total utilizando los métodos oficiales (OIV, 2012). La cuantificación de los compuestos fermentativos volátiles se realizó mediante cromatografía de gases (CG-FID) y gases masas (CG-MS) según el método descrito en Bouzas-Cid et al. (2018).

En la valoración sensorial de los vinos participó un panel de 11 catadores expertos. La ficha de cata incluía diversos descriptores olfativos y gustativos puntuados en una escala de 1 a 9. Los catadores indicaron también el orden de preferencia por los vinos.

La existencia de diferencias significativas entre los vinos elaborados con distintas levaduras se determinó mediante un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el software SPSS 18.0. El análisis de componentes principales se realizó utilizando el software PAST3.20.

Resultados y discusión
Evolución de las fermentaciones:

La cinética fermentativa de los ensayos con las distintas levaduras se muestra en la Fig. 1A. Las diferencias se apreciaron especialmente en el inicio de la fermentación. S. cerevisiae XG3 y T. delbrueckii Td315 comenzaron el proceso a los 2 días y S. bacillaris Sb474 al tercer día. Sin embargo, con L. thermotolerans Lt93 y en el proceso espontáneo el inicio se retrasó 6 días y, hasta 9 días con M. fructicola Mf278. Una vez arrancadas las fermentaciones y tras añadir el segundo inóculo (S. cerevisiae XG3), la fermentación evolucionó normalmente. En cuanto a la dinámica de la población de levaduras a nivel cuantitativo la tendencia varió según el ensayo (Fig. 1B). En la fermentación espontánea las levaduras del mosto se multiplicaron hasta alcanzar la cantidad necesaria para iniciar la fermentación, su cantidad siguió aumentando hasta la fase tumultuosa y disminuyó ligeramente hacia el final del proceso. El ensayo con Sb474 mostró una tendencia similar, aunque la población de levaduras era más elevada. El ensayo de Mf278 también presentó este patrón, pero la disminución del número de levaduras en fase final era menos acusada. Sin embargo, en los demás ensayos se observó un comportamiento diferente: con la cepa Lt93 casi no había diferencias en la población de levaduras entre las distintas fases; con Td315, el número de levaduras era elevado al inicio del proceso para ir disminuyendo en fase tumultuosa y final; y, finalmente, con XG3 la población aumentó a lo largo del proceso hasta el final.

Control de implantación de las levaduras inoculadas:
Los análisis microbiológicos y genéticos para ver la capacidad de implantación de las cepas inoculadas y su contribución a las características finales del vino también mostraron diferencias entre las levaduras. En la fermentación control con S. cerevisiae XG3, esta cepa se impuso al 100% sobre las levaduras presentes en el mosto (Fig. 2). Sin embargo, en el proceso espontáneo se observó una elevada diversidad de hasta 15 cepas diferentes de S. cerevisiae, con predominio de dos de ellas.

En las fermentaciones secuenciales, el porcentaje de implantación de la levadura inoculada y su permanencia una vez añadido el segundo inóculo varió entre las especies (Fig. 2). Así, Td315 y Sb474 aparecían con una elevada proporción, >85% y 77% respectivamente, desde el inicio hasta el final de la fermentación. Sin embargo, la levadura Mf278 era claramente desplazada por S. cerevisiae. En todas ellas, la segunda levadura inoculada, XG3, era la cepa de S. cerevisiae dominante. En contraste, Lt93 no fue capaz de implantarse en la fermentación, su frecuencia era muy baja en todas las fases. Además, en este caso, tampoco se implantó la segunda levadura; se identificaron distintas cepas de S. cerevisiae además de XG3, al igual que en la fermentación espontánea.

Caracterización de los vinos obtenidos:
Las levaduras que intervienen en la fermentación determinan el perfil químico y sensorial de los vinos. En este estudio se observaron diferencias significativas entre los vinos en el contenido en alcohol, acidez total, glicerol y varios grupos de compuestos volátiles (Tabla 1). Estas diferencias determinaron el perfil sensorial y la preferencia de los catadores por los vinos.

El grado alcohólico era más elevado en la fermentación espontánea y la inoculada con S. cerevisiae XG3. Con las levaduras no-Saccharomyces se redujo ligeramente el grado en el caso de Metschnikowia Mf278 y L. thermotolerans Lt93, y en mayor medida con S. bacillaris Sb474. Esta última cepa también aumentó acidez total y el contenido en glicerol. Con T. delbrueckii Td315 se obtuvieron vinos de menor grado que con S. cerevisiae, pero con presencia de azúcares y acidez total mayor. En cuanto a la cuantificación de los aromas fermentativos, las cepas XG3 y Metschnikowia Mf278 presentaron mayor concentración de acetatos y ésteres, relacionados con aromas afrutados, por lo que fueron los mejor evaluados a nivel sensorial por los catadores (Tabla 1). T. delbrueckii Td315 dio lugar a una elevada concentración de ácidos grasos en el vino. Estas diferencias en la composición permitieron separar claramente los vinos mediante un análisis de componentes principales (Fig. 3).

Conclusiones
Aunque las levaduras no-Saccharomyces presentan un menor potencial fermentativo, y su grado de implantación en la fermentación varía de unas especies a otras, su uso combinado con S. cerevisiae permite completar la fermentación y obtener vinos menos alcohólicos. Además, en algunos casos, la aplicación de levaduras no-Saccharomyces y Saccharomyces mediante inoculación secuencial potencia la formación de compuestos fermentativos que repercuten positivamente en la calidad de los vinos.

Agradecimientos
Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Biodiversidad del Ministerio para la Transición Ecológica (proyecto PRCV00458) y del INIA (proyecto RTA2012-00021-C03-01, cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). David Castrillo agradece al INIA y al Fondo Social Europeo su contrato predoctoral-FPI. Las opiniones y documentación aportadas en esta publicación son de exclusiva responsabilidad de los autores de los mismos, y no reflejan necesariamente los puntos de vista de las entidades que apoyan económicamente el proyecto.

Bibliografía
1. BENITO, S. 2018. The impact of Torulaspora delbrueckii yeast in winemaking. Appl Microbiol Biotechnol. 102, 3081-3094.
2. BOUZAS-CID, Y., FALQUÉ, E., ORRIOLS, I., MIRÁS-AVALOS, JM. 2018. Effects of irrigation over three years on the amino acid composition of Treixadura (Vitis vinifera L.) musts and wines, and on the aromatic composition and sensory profiles of its wines. Food Chemistry. 240, 707-716.
3. ENGLEZOS, V., RANTSIOU, K., CRAVERO, F., TORCHIO, F., ORTIZ-JULIEN, A., GERBI, V., ROLLE, L., COCOLIN, L. 2016. Starmerella bacillaris and Saccharomyces cerevisiae mixed fermentations to reduce ethanol content in wine. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 5515-5526.
4. GOBBI, M., COMITINI, F., DOMIZIO, P., ROMANI, C., LENCIONI, L., MANNAZZU, I., CIANI, M. 2013. Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in simultaneous and sequential co-fermentation: A strategy to enhance acidity and improve the overall quality of wine. Food Microbiol. 33, 271-281.
5. OIV. International Organization of Wine. 2012. Compendium of international methods of wine and must analysis. Vol. 1 y 2. Paris. http://www.oiv.int.
6. VARELA, C., SENGLER, FA., SOLOMON, M., CURTIN, C. 2016. Volatile flavour profile of reduced alcohol wines fermented with the non-conventional yeast species Metschnikowia pulcherrima and Saccharomyces uvarum. Food Chem. 209: 57-64.
7. VARELA, C., DRY, PR., KUTYNA, DR., FRANCIS, IL., HENSCHKE, PA., CURTIN, CD., CHAMBERS, PJ. 2015. Strategies for reducing alcohol concentration in wine. Aus J Grape Wine Res. 21, 670-679.


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